Les molécules organiques, et plus particulièrement les biomolécules, sont synthétisées selon diverses stratégies : en solution (phase homogène) ou sur support (phase hétérogène) incluant phase solide (molécules en croissance sur un matériau insoluble) et phase liquide (molécules en croissance sur un support polymérique à solubilité variable). Toutes ces approches synthétiques, dans leurs versions automatisées, permettent la production rapide de collections de composés isolés ou en mélange (chimie combinatoire). Il est alors impératif de réaliser l’indispensable contrôle analytique également en mode haut débit. Quelles que soient les stratégies de synthèse utilisées, les produits sont décrochés du support en fin de synthèse et analysés en solution (Cleave and Analyze). Les techniques d’ionisation à pression atmosphérique telle que l’Electrospray et l’APCI couplées à des systèmes de chromatographie liquide en mode analytique et en mode préparatif permettent l’analyse et la purification de chimiothèques à haut débit.
[1] J-L. Aubagnac, C. Drouot, C. Enjalbal, P. Fulcrand & J. Martinez,
Annales de Quimica Int. Ed., 1998, 94, 262-268, Monitoring of peptides libraries by Fast Atom Bombardment and Electrospray Ionization mass spectrometry
[2] J-L. Aubagnac, M. Amblard, C. Enjalbal, G. Subra, J. Martinez, P. Durand & P. Renaut,
Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 1999, 2, 289-296, Identification of synthetic by-products in combinatorial libraries using high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry.
[3] C. Enjalbal, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
Mass Spectrom. Rev., 2000, 19, 139-161, Mass spectrometry in combinatorial chemistry.
[4] G. Subra, L. Soulère, P. Hoffmann, C. Enjalbal, J-L. Aubagnac & J. Martinez
QSAR & Comb. Sci., 2003, 22, 646-651, Parallel and mixture combined approach : Rapid cheap synthesis and characterization of a 4096-tripeptides library.
[5] P. Verdié, G. Subra, L. Feliu, P. Sanchez, G. Bergé, G. Garcin & J. Martinez,
J. Comb. Chem., 2007, 9, 254-262, On-Line Synthesis of Pseudopeptide Library Incorporating a Benzodiazepinone Turn Mimic : Biological Evaluation on MC1 Receptors. _

Parallèlement à la démarche classique d’analyse à haut débit de produits en solution par spectrométries de masse ESI et MALDI, la caractérisation par spectrométrie de masse de molécules ancrées sur support polymérique lors de synthèses en phase solide impose des contraintes spécifiques. En effet, le contrôle analytique doit être non destructif et direct (sans décrocher le produit du support polymérique) afin de suivre in situ et pas à pas les réactions. A côté des réactions classiques impliquées dans la formation d’ions en phase gazeuse telles que les réactions d’oxydo-réduction et les réactions acido-basiques, le paramètre de solubilité (ou d’insolubilité) de l’échantillon s’avère crucial. Ainsi, dans le cas de synthèses en phase solide, le recours à un matériau insoluble nécessite l’emploi d’une technique d’ionisation permettant l’analyse de surfaces. En effet, toutes les techniques de spectrométrie de masse utilisées en chimie et en biologie (communément ESI et MALDI) nécessitent au préalable la solubilisation de l’échantillon. La technique S-SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry) qui implique la désorption d’ions à partir d’un échantillon solide nous a permis d’aborder le problème de l’insolubilité en synthèse organique et d’élargir ainsi la palette du contrôle analytique à l’analyse de surfaces. Cette technique d’ionisation par désorption, antérieure aux techniques FAB et MALDI, permet d’éjecter des ions en phase gazeuse sous l’effet du bombardement énergétique de la surface de l’échantillon. Alors que les techniques FAB et MALDI utilisent des molécules organiques, les matrices, pour assister le processus d’ionisation (matrice liquide pour le FAB et solide pour le MALDI), la technique SIMS ne nécessite aucun traitement de l’échantillon ni aucun adjuvant d’ionisation. L’analyse directe de solide est ainsi possible. La puissance du bombardement que subit l’échantillon est ajustée pour caractériser une zone en surface (régime statique, S-SIMS) ou effectuer une analyse en profondeur (régime profilage). Nous avons mis en œuvre, en collaboration avec Mr R. Combarieu de l’Ecole des Mines de Paris, la technique S-SIMS pour caractériser des échantillons issus de synthèses en phase solide sur résines et sur supports pelliculaires. La cartographie de l’échantillon est accessible en mode imagerie permettant ainsi en une seule acquisition de caractériser des mélanges issus de chimie combinatoire (bibliothèques Mix and Split) ou créés artificiellement par regroupement d’échantillons pour accélérer le contrôle analytique. Il est à noter que l’imagerie en spectrométrie de masse (techniques S-SIMS et MALDI) se développe actuellement à l’interface chimie-biologie comme un nouvel outil d’imagerie biologique.

[1] J-L. Aubagnac, C. Enjalbal, G. Subra, A.M. Bray, R. Combarieu & J. Martinez,
J. Mass Spectrom., 1998, 33, 1094-1103, Application of time-of-flight secondary ion mass spectrometry to in situ monitoring of solid phase peptide synthesis on the MultipinTM system.
[2] C. Enjalbal, J. Martinez, G. Subra, R. Combarieu & J-L. Aubagnac,
Rapid Commun. Mass Spectrom., 1998, 12, 1715-1720, Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry of Fmoc-amino Acids Linked to Solid Supports Through Ionic Interactions.
[3] J-L. Aubagnac, C. Enjalbal, C. Drouot, R. Combarieu & J. Martinez,
J. Mass Spectrom., 1999, 34, 749-754, Imaging Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry of Solid-phase Peptide Syntheses
[4] C. Enjalbal, D. Maux, G. Subra, J. Martinez, R. Combarieu & J-L. Aubagnac,
Tetrahedron Lett., 1999, 40, 6217-6220, Monitoring and quantification on solid support of a by-product formation during peptide synthesis by Tof-SIMS.
[5] C. Enjalbal, D. Maux, J. Martinez, R. Combarieu & J-L. Aubagnac,
Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 2001, 4, 363-373, Mass Spectrometry and Combinatorial Chemistry : New approaches for direct support-bound compound identification.
[6] D. Maux, C. Enjalbal, J. Martinez, J-L. Aubagnac & R. Combarieu,
J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2001, 12, 1099-1105, Static Secondary Ion Mass Spectrometry to monitor solid-phase peptide synthesis.
[7] C. Enjalbal, D. Maux, R. Combarieu, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
J. Comb. Chem., 2003, 5, 102-109, Imaging combinatorial libraries by mass spectrometry : from Peptide to organic-supported syntheses.

Rendre compte du comportement d’un composé en spectrométrie de masse implique que les phénomènes de la chimie (réactions acido-basiques, réactions d’oxydo-réduction et propriétés de solubilisation) soient pris en considération. Alors que les techniques d’ionisation douce telle que ESI, FAB et MALDI se basent principalement sur des phénomènes acido-basiques afin de produire des espèces protonés ou déprotonés, les réactions d’oxydo-réduction ont aussi été mises en évidence, en particulier en spectrométrie de masse FAB. Par contre, la problématique de la solubilité des composés à analyser ne se pose pas tant que l’on considère des molécules de faibles poids moléculaires ou des biomolécules, celles-ci étant, de par leur nature, toujours solubles dans des solvants protiques. Néanmoins, l’élargissement des domaines d’application de la spectrométrie de masse à tout type de composés, incluant les polymères synthétiques de hauts poids moléculaires, nécessite de considérer ce paramètre solubilité/insolubilité. Nous nous sommes intéressés dans le cadre des synthèses effectuées à l’UMR 5247 à cette problématique. Dans le cadre de synthèses sur support polymérique, la modulation de la solubilité par l’utilisation de polymères à solubilité variable de type polyéthylène glycol (PEG) permet de basculer à façon d’une phase homogène (solubilisation) à une phase hétérogène (précipitation). Ainsi, les synthèses en phase liquide, développées comme alternative aux synthèses en phase solide, permettent d’utiliser toutes les techniques usuelles d’analyse de polymères (spectrométries de masse ESI et MALDI). Les molécules en croissance greffées sur le squelette polymérique connu (PEG) constituent le groupe terminal à identifier. Afin de satisfaire les contraintes de haut débit, l’acquisition et l’interprétation des données ont été automatisées.

[1] F. Nativel, C. Enjalbal, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
Eur. Mass Spectrom., 1998, 4, 233-237, Electrospray mass spectrometry analysis of liquid-phase organic synthesis.
[2] B. Sauvagnat, C. Enjalbal, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
Rapid Commun. Mass Spectrom., 1998, 12, 1034-1037, Step-by step monitoring of a liquid phase organic synthesis by electrospray mass spectrometry.
[3] C. Enjalbal, B. Sauvagnat, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez, P. Mouchet, F. Roux & J-L. Aubagnac,
Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, 1775–1781, Chemical reactivity in Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry. _ [4] S. Varray, J-L. Aubagnac, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez & C. Enjalbal
European Journal of Analytical Chemistry, 2000, 28, 263-268, Poly(ethyleneglycol) in ESI mass spectrometry.
[5] C. Enjalbal, F. Lamaty, P. Sanchez, E. Suberchicot, P. Ribière, S. Varray, R. Lazaro, N. Yadav-Bhatnagar, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
Anal. Chem., 2003, 75, 175-184, Characterization of soluble polymer supported organic compounds by LC/Electrospray ionization MS towards a complete automation of the liquid-phase process in combinatorial chemistry.
[6] C. Enjalbal, P. Ribière, F. Lamaty, N. Yadav-Bhatnagar, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005, 16, 670-678, MALDI-TOF MS analysis of soluble PEG based multi-step synthetic reaction mixtures with automated detection of reaction failure.

Tout contrôle analytique implique non seulement de détecter et identifier les composés présents dans un mélange complexe mais aussi de les doser. La spectrométrie de masse couplée à une technique séparative (LC/ESI-MS) et le recours au marquage isotopique satisfont les contraintes d’un tel contrôle en matière de sensibilité, spécificité, durée d’enregistrement et traitement des données.
[1] C. Farenc, C. Enjalbal, P. Sanchez, F. Bressolle, M. Audran, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
J. Chromatogr. A, 2001, 910, 61-67, Quantitative determination of rocuronium in human plasma by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry.
[2] C. Enjalbal, R. Roggero, R. Cerdan, J. Martinez, H. Vial & J-L. Aubagnac,
Anal. Chem. 2004, 76, 4515-4521, Automated monitoring of phosphatidylcholine biosyntheses in Plasmodium falciparum by electrospray ionization mass spectrometry through stable isotope labeling experiments.

En protéomique, les identifications de protéines reposent sur la caractérisation par spectrométrie de masse de séquences peptidiques composées au minimum de six aminoacides caractéristiques d’un protéome donné. Pour ce faire, chaque protéine isolée par diverses techniques séparatives est tout d’abord soumise à une digestion enzymatique ; le mélange de peptides ainsi obtenu est analysé par spectrométrie de masse MALDI (cartographie peptidique massique) et par spectrométrie de masse ESI en tandem (LC/ESI-MS/MS) afin de générer des informations de séquence. Les résultats obtenus sont ensuite confrontés aux séquences de protéines connues archivées dans diverses bases de données. L’étape de séquençage peptidique s’avère cruciale et repose sur l’acquisition de spectres MS/MS de qualité ainsi que sur une connaissance approfondie des mécanismes de dissociation en phase gazeuse des peptides. Nous avons donc apporté notre contribution à l’élaboration de modèles de fragmentation de peptides dans des conditions de dissociations basses énergies induites par collision (instruments de type QqQ, Trappe d’ions, QqTof) afin d’améliorer les logiciels d’interprétation automatisée de spectres MS/MS. Les paramètres instrumentaux et structuraux ont été étudiés en se basant sur une approche statistique (étude de plus de 300 peptides synthétiques de séquences variées : longueur, composition en acides aminés, modification de chaînes latérales, modification des extrémités N ou C-terminales, …).

[1] D. Maux, C. Enjalbal, J. Martinez & J-L. Aubagnac, Rapid Commun.
Mass Spectrom., 2002, 16, 1470-1475, New example of a proline-induced fragmentation in ESI mass spectrometry of peptides.
[2] L. Mouls, G. Subra, C. Enjalbal, J. Martinez & J-L. Aubagnac,
Tetrahedron Lett., 2004, 45, 1173-1178, O-N-Acyl migration in N-terminal serine containing peptides : mass spectrometric elucidation and subsequent development of site-directed acylation protocols.
[3] L. Mouls, G. Subra, J-L. Aubagnac, J. Martinez & C. Enjalbal,
J. Mass Spectrom., 2006, 41, 1470-1483, Tandem mass spectrometry of amidated peptides.
[4] L. Mouls, J-L. Aubagnac, J. Martinez & C. Enjalbal,
J. Prot. Res. 2007, 6, 1378-1391. Low energy Peptide fragmentations on an ESI-Q-Tof type mass spectrometer.
[5] N. Shenar, J. Martinez & C. Enjalbal,
J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2008, 19, 632-644. Laser Desorption/ionization mass spectrometry on porous silica and alumina for peptide mass fingerprinting.
[6] N. Shenar, N. Sommerer, J. Martinez & C. Enjalbal,
J. Mass Spectrom. 2009, 44, 621-632. Comparison of LID versus CID activation modes in tandem mass spectrometry of peptides.

L’EC est une méthode de choix pour la séparation de biomolécules. Cependant l’analyse des biomolécules, en particulier des peptides et des protéines, est limitée par des phénomènes d’adsorption de ces peptides/protéines sur la paroi interne des capillaires, ce qui réduit l’efficacité des séparations. Par conséquent nous nous sommes intéressés au développement de greffages non-covalents mono et multi-couches de capillaires par des poly-électrolytes afin de limiter les phénomènes d’adsorption et d’améliorer les performances analytiques:
Etude fondamentale: influence des conditions de greffage sur la performance des recouvrements, étude de stabilité des recouvrements, etc…
Applications: séparation de mélanges complexes de protéines et/ou de peptides, caractérisation de diastéréoisomères d’un sécrétagogue de l’hormone de croissance

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Publications :

R. Nehmé, C. Perrin, V. Guerlavais, J. A. Fehrentz, H. Cottet, J. Martinez, H. Fabre, accepted for publication in Electrophoresis 2009, Use of coated capillaries for the electrophoretic separation of a growth hormone secretagogue.
R. Nehmé, C. Perrin, H. Cottet, M.D. Blanchin, Electrophoresis, 2009, 30, 1888-1898 Influence of polyelectrolyte coating conditions for protein analysis in capillary electrophoresis.
R. Nehmé, C. Perrin, H. Cottet, M.D. Blanchin, H. Fabre, Electrophoresis 2008, 29, 3013-3023, Prevention of adsorption phenomena in peptide and protein analysis by capillary electrophoresis: influence of polyelectrolyte coating conditions on coating stability and separation efficiency.
A.M. Garcia Campana, M. Taverna, H. Fabre, Electrophoresis 2007, 28, 208-232, Laser Induced Fluorescence for the detection of peptides and proteins in capillary electrophoresis.

Développement de nouvelles méthodologies analytiques (électrophorèse capillaire et chromatographie liquide) pour l’analyse de molécules d’intérêt pharmaceutique dans des matrices complexes (formulations, milieux biologiques…) Approches chimiométriques: optimisation (plans d’expérience), validation de méthodes, étude de la robustesse
Etude fondamentale: étude de nouveaux supports chromatographiques pour l’analyse de composés présentant des propriétés physicochimiques très différentes (anticancéreux et métabolites); amélioration des limites de détection en EC (méthodes de préconcentration en ligne)
Applications: contrôle de qualité de formulations pharmaceutiques, test de la pureté de principes actifs/ identification de substances apparentées, dosage dans les milieux biologiques de médicaments et de leurs métabolites actifs.

Publications :

C. Perrin, G. Coussot, I. Tournier, C. Perigaud, H. Fabre, J. Chromatogr. A 2006, 1111, 139-146 Separation of 3’-azido-2’,3’-dideoxythymidine pronucleotide diastereoisomers in biological samples by CZE with cyclodextrin addition.
I. Lefebvre, J-Y. Puy, C. Perrin, C. Périgaud, J. Chromatogr. B 2007, 858, 2-7, Quantification of zidovudine and its monophosphate in cell extracts by on-line solid-phase extraction coupled to liquid chromatography.
M.H.Gouy, H. Fabre, M..D. Blanchin, S.Peyrottes, C. Périgaud, I. Lefebvre, Analytica Chimica Acta 2006, 566(2), 178-184, Quantification of 5’- monophosphate cytosine arabinoside (araCMP) in cell extracts using liquid chromatography-electrospray mass spectrometry.
T. D. Thi, R. Pomponio, R. Gotti, J. Saevels, B. Van Hove, W. Van Ael, N. Matthijs, Y. Vander Heyden, R. Marini Djan’geing’a, P. Chiap, P. Hubert, J. Crommen, H. Fabre, P. Dehouck, J. Hoogmartens, A. Van Schepdael, Electrophoresis 2006, 27(12), 2317-2329 Precision study on capillary electrophoresis methods for metacycline.
E. Cheble, G. Nguema, H. Fabre, Analytica Chimica Acta 2005, 533(2), 121-125, Stability indicating assay using capillary electrophoresis for an azaphenothiazine in an ointment formulation.

B) Développement de méthodologies bioanalytiques pour le dosage de peptides, protéines et autres molécules d’intérêt thérapeutique

Ce deuxième axe de recherche consiste à l’élaboration de nouvelles méthodologies bioanalytiques pour:
1/ la préparation d’échantillons d’origine biologique/environnemental,
2/ le dosage de composés divers et variés (peptides, protéines, anticancéreux) à l’état de traces en milieux complexes.

Etude fondamentale:
1- Etude des procédés d’immobilisation covalente et sélective de biomolécules (peptides, protéines naturelles ou de synthèse, fragments d’ADN,…) sur supports de silice et polymériques en vue de la préparation de supports d’extraction.
Développements de méthodes colorimétriques pour le dosage direct de macromolécules en solution ou immobilisées sur support solide Applications: Isolation sélective de peptides N-terminaux bloqués (biomarqueurs) et identification de protéines cibles modifiées en phase post-traductionnelle, caractérisation de supports solides: détermination de la densité d’amines de surface quantification des amines de surface, stabilité des greffages.

Publications

G. Coussot, E. Nicol, A. Commeyras, I. Desvignes, R. Pascal, O. Vandenabeele-Trambouze, Polymer International, 2009, 58, 511-518. Colorimetric quantification of amino groups in linear and dendritic structures.
G. Coussot, H.D. Hawke, A. Murlaz, J.M. Koomen, R. Kobahyashi, Analytical Biochemistry 2007, 361, 302-304, A method for the isolation of blocked N-terminal peptides.